Genoma de Solanum americanus

Nature Genetics (2023)Citar este artículo

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Los cultivos de papa (Solanum tuberosum) y tomate (Solanum lycopersicon) sufren graves pérdidas por el tizón tardío causado por el patógeno oomiceto Phytophthora infestans. Solanum americanum, un pariente de la papa y el tomate, está distribuido globalmente y la mayoría de las muestras son altamente resistentes al tizón. Generamos genomas de referencia de alta calidad de cuatro muestras de S. americanum, volvimos a secuenciar 52 muestras y definimos una pan-NLRoma de genes de receptores inmunes de S. americanum. Además, analizamos la variación en el reconocimiento de 315P. infestans Efectores RXLR en 52 accesiones de S. americanum. Utilizando estos datos genómicos y fenotípicos, clonamos tres genes que codifican NLR, Rpi-amr4, R02860 y R04373, que reconocen los efectores RXLR de P. infestans afines PITG_22825 (AVRamr4), PITG_02860 y PITG_04373. Estos recursos y metodologías genómicas respaldarán los esfuerzos para diseñar papas con resistencia duradera al tizón tardío y se pueden aplicar a enfermedades de otros cultivos.

La papa es uno de los cultivos no cereales más consumidos en todo el mundo. Sin embargo, las plagas y enfermedades reducen los rendimientos globales en aproximadamente un 17% (ref. 1). El tizón tardío de la papa, causado por el patógeno oomiceto Phytophthora infestans2, desencadenó la hambruna irlandesa en la década de 1840 y sigue siendo la enfermedad más dañina para la producción mundial de papa1.

La inmunidad de las plantas depende del reconocimiento de patógenos tanto por los receptores de reconocimiento de patrones de la superficie celular (PRR) como por los receptores inmunes intracelulares. Muchos genes R contra P. infestans (genes Rpi) se clonaron a partir de parientes silvestres de especies de papa, como R2, R3a, R8, Rpi-blb1, Rpi-blb2 y Rpi-vnt1 de Solanum demissum, Solanum bulbocastanum y Solanum venturii3,4 ,5,6,7,8,9,10. Sin embargo, la mayoría de los genes Rpi clonados han sido superados por el patógeno de rápida evolución.

Los efectores de P. infestans llevan un péptido señal y un motivo RXLR-EER (donde X representa cualquier aminoácido). En el genoma de referencia de P. infestans (cepa T30-4), se predijeron 563 efectores RXLR, lo que permitió realizar pruebas para el reconocimiento de estos efectores ("efectorómicos") en varias plantas11,12.

Se han determinado secuencias genómicas de referencia de patata, tomate, berenjena y pimiento13,14,15,16. También se encuentran disponibles ensamblajes genómicos graduales a nivel de cromosomas de papas heterocigotas diploides y tetraploides17,18,19. También han surgido estudios pangenómicos de plantas de cultivo, incluida la papa, que arrojan luz sobre la extensa variación genética en estas especies20,21,22,23. Se han desarrollado métodos de captura de secuencias para secuenciar los repertorios de genes NLR (RenSeq) y PRR (RLP/KSeq) de plantas que reducen la complejidad genómica y los costos de secuenciación24,25,26. Estos métodos han dado lugar a muchas aplicaciones importantes, como AgRenSeq, y a la definición del pan-NLRome de Arabidopsis27,28.

El Solanum americanum diploide es muy resistente al tizón tardío. Anteriormente, nuestro grupo clonó Rpi-amr1 y Rpi-amr3 de varias accesiones resistentes de S. americanum junto con sus efectores afines AVRamr1 y AVRamr3 (refs. 25,29,30,31).

Aquí, secuenciamos y ensamblamos cuatro genomas de alta calidad de S. americanum, volvimos a secuenciar 52 accesiones y definimos la pan-NLRoma de S. americanum. También analizamos 315 efectores RXLR de P. infestans en 52 accesiones de S. americanum. Estos recursos genómicos y datos funcionales llevaron a la rápida identificación de tres nuevos genes que codifican NLR, Rpi-amr4, R02860 y R04373, que son responsables del reconocimiento de PITG_22825 (AVRamr4), PITG_02860 y PITG_04373, respectivamente. Este estudio revela un panorama de interacción de inmunidad activada por efectores (ETI) entre S. americanum y P. infestans que nos permitirá clonar más genes Rpi del acervo genético de especies silvestres de Solanum y profundizar nuestro conocimiento sobre la resistencia al tizón tardío en parientes silvestres de papa. El diseño del genoma de la papa impulsado por la genómica de la papa que aprovecha nuevas tecnologías de fitomejoramiento32 ayudará a desarrollar mejores variedades de papa con resistencia duradera al tizón tardío.

S. americanum es una especie de Solanaceae distribuida globalmente que es resistente a muchos patógenos, incluidos P. infestans y Ralstonia solanacearum25,29,33. Se seleccionaron cuatro muestras de S. americanum SP1102, SP2271, SP2273 y SP2275 para la secuenciación en función de su variación en la resistencia al tizón tardío (Figuras complementarias 1a, b). Generamos lecturas de extremos emparejados de PacBio de alta fidelidad, Oxford Nanopore e Illumina y ensamblamos los genomas de SP1102, SP2271, SP2273 y SP2275 en contigs (Nota complementaria 1). También generamos datos de Hi-C para SP1102, SP2271 y SP2273, y anclamos los contigs en 12 pseudomoléculas (Nota complementaria 1 y Figuras complementarias 2 y 3). BUSCO estimó que la integridad de estos ensamblajes era ~ 98,4% (copia única y duplicada), lo que indica la alta calidad del ensamblaje del genoma (Figura complementaria 4a). Para anotar modelos genéticos, aplicamos EVidenceModeler o GeMoMa para integrar la predicción ab initio, la anotación basada en homología y la evidencia del transcriptoma para SP1102/SP2271 o SP2273/SP2275. En resumen, predijimos un promedio de 34,193 modelos genéticos con un promedio de evaluación BUSCO del 98,1% (copia única y duplicada) para cada genoma de S. americanum (Figura complementaria 4b y Tabla 1).

Para investigar la evolución de los genomas de S. americanum, agrupamos las secuencias de proteínas representativas de 15 genomas, que comprenden los genomas de cuatro muestras de S. americanum, cuatro muestras de papa, tres muestras de tomate, cuatro especies adicionales de Solanaceae y una especie externa de Arabidopsis thaliana. en 33,115 ortogrupos, de los cuales identificamos además 1,363 ortogrupos de copia única. La topología del árbol de especies sugiere que S. americanum es una especie hermana del ancestro común de la papa y el tomate y divergió hace ~14,1 millones de años (Ma; 95% del intervalo de densidad posterior más alto, 11,7–17,2 Ma; Fig. 1a), que es consistente con un informe anterior basado en secuencias de plástidos34.

a, Relación filogenética de S. americanum y especies vecinas. El número rojo indica el arranque de cada nodo. El número negro indica el tiempo estimado de divergencia (hace millones de años). La barra de escala representa el número de sustituciones de aminoácidos por sitio. b, Sintenia del genoma de S. americanum, patata y berenjena. Las cintas entre los cromosomas muestran regiones sinténicas. Los reordenamientos cromosómicos grandes (>1 Mb de tamaño) están marcados en naranja.

Datos fuente

El reordenamiento cromosómico (CR) es un proceso evolutivo importante35. Los ensamblajes del genoma de grado de referencia nos permitieron explorar la evolución cromosómica de S. americanum. Observamos 45 CR grandes (> 1 Mb de tamaño), que comprenden 26 eventos de inversión y 19 eventos de translocación entre cromosomas, entre los genomas de S. americanum y de la papa (Fig. 1b y Fig. 5 complementaria). Por el contrario, se encontraron 67 CR grandes (30 inversiones y 37 translocaciones entre cromosomas) entre S. americanum y la berenjena (Fig. 1b). En particular, las CR no se distribuyeron uniformemente en todo el genoma. No se identificó ninguna CR en el cromosoma 2 entre S. americanum y la papa, mientras que se produjeron 11 CR en el cromosoma 11.

Las variaciones estructurales (SV), incluidas las inserciones, eliminaciones, duplicaciones, inversiones y translocaciones, causan y mantienen la diversidad fenotípica36. Los conjuntos de cromosomas de tres genomas de S. americanum permitieron el análisis de SV grandes (>1 Mb de tamaño). Utilizando SP1102 como referencia, identificamos 56 SV grandes en SP2271 (Figura complementaria 6a), lo que afecta ~ 256 Mb del genoma de referencia. Sin embargo, solo se identificaron 14 SV grandes en SP2273, que cubren ~ 54 Mb del genoma de referencia (Figura complementaria 6b). La mayoría de los SV residen en contigs únicos y están respaldados por el mapa de interacción Hi-C, lo que sugiere la alta confiabilidad de la identificación de SV (Figura complementaria 6c y Tabla complementaria 1). Las grandes diferencias en el número de SV entre los genomas de S. americanum arrojan luz sobre su compleja historia evolutiva. Además, caracterizamos los SV pequeños (de 40 pb a 1 Mb de tamaño) entre los genomas de S. americanum y descubrimos que los SV podrían contribuir a la expresión diferencial de 1084 genes entre las hojas SP1102 y SP2271 (Nota complementaria 2 y Figuras complementarias 7 y 8). .

Para comprender la diversidad de genes NLR, se generó un árbol filogenético utilizando el dominio NB-ARC de las proteínas NLR de SP1102 (Fig. 2a) y la posición de estos genes NLR en el genoma SP1102 se visualizó en el mapa físico (Fig. 2b). . Encontramos que el 71% de los genes SP1102 NLR estaban en grupos y el resto eran únicos (Fig. 2c). Debido a la complejidad de los grupos de genes NLR, la mayoría de los canales de anotación automática producen modelos genéticos incorrectos37. Para generar mejores modelos de los genes NLR, anotamos manualmente 528, 579 y 524 genes NLR de los genomas SP1102, SP2271 y SP2273 incorporando resultados del anotador NLR y datos de secuencia de ADNc (Fig. 2d). A continuación, se compararon los polimorfismos de presencia/ausencia (P/A) de los genes NLR entre las muestras de S. americanum (Fig. 2a). Además, se construyó un pan-NLRome, lo que sugiere que las accesiones en nuestra investigación son representativas del repertorio NLR de S. americanum (Nota complementaria 3 y Figura complementaria 9).

a, Los dominios NB-ARC de S. americanum SP1102 fueron predichos por el anotador NLR y se utilizaron para generar un árbol de máxima verosimilitud utilizando IQ-TREE con el modelo JTT + F + R9. Se incluyeron proteínas NLR conocidas de especies de Solanaceae (resaltadas en rojo). Los NLR se clasifican en diferentes grupos en base a un informe previo29. Se muestran los superclados RNL, TNL y NRC. Como grupo externo se utilizó CED-4 de Caenorhabditis elegans. El perfil de expresión se muestra mediante un mapa de calor (de blanco a rojo) basado en los datos de ADNc RenSeq de SP1102. El mapa de calor (de blanco a azul) muestra el polimorfismo P/A de los NLR de los otros tres genomas de S. americanum y los ensamblajes SMRT RenSeq de 16 muestras adicionales. El orden de adhesión de arriba a abajo es SP3409, SP3408, SP3406, SP3400, SP3399, SP3370, SP2360, SP2308, SP2307, SP2300, SP2298, SP2272, SP1123, SP1101, SP1034, SP1032, SP2275, SP2273 y SP2271. . Los NLR ausentes se muestran mediante bloques negros. La barra de escala representa el número de sustituciones de aminoácidos por sitio. b, El mapa físico de los genes NLR en el genoma SP1102. Los CNL se muestran con bloques amarillos, los TNL se muestran con bloques rojos y los RNL se muestran con bloques rosas. En este mapa se indican algunos grupos de NLR caracterizados funcionalmente. Se muestran algunos grupos NLR informados anteriormente (NRC1, NRG1, R3, ADR1, NRC3, R1, RB, Rpi-vnt1, NRC2, Rpi-chc1, Rpi-amr1, NRC6, NRC4b, NRC5, NRC4a, Rpi-amr3, Gpa2). en el mapa físico. (c) La proporción de NLR únicos y NLR en grupos. d, Número de genes NLR seleccionados manualmente (círculo rojo) y número de genes NLR predichos por el anotador NLR (círculo amarillo). No se realizó la curación manual de genes NLR de SP2275. e, Filogenia de la familia NLR auxiliar de NRC. Los homólogos NRC de patata, tomate y N. benthamiana están marcados en naranja, rojo y verde, respectivamente. Las proteínas NRC de S. americanum están en negro. El número indica el arranque de cada nodo. La barra de escala representa el número de sustituciones de aminoácidos por sitio. f, Los valores de TPM transformados log10 para genes NLR se clasifican en cinco grupos y se anotan algunos homólogos de genes R conocidos. Los ID de NLR se muestran en la Tabla complementaria 2.

También inspeccionamos el nivel de expresión de los genes SP1102 NLR volviendo a analizar los datos de ADNc de RenSeq25. Los valores de transcripciones por millón (TPM) de genes NLR se visualizaron con un mapa de calor (Fig. 2a). Muchos genes NLR conocidos se expresaron relativamente alto, como el sensor NLR Rpi-amr3 y los NLR auxiliares ADR1, NRG1, NRC4a, NRC2 y NRC3 (Fig. 2f y Tabla complementaria 2). Muchas NLR en espiral de Solanaceae (CC-NLR o CNL) requieren NRC NLR auxiliares que están filogenéticamente relacionadas y encontramos que alrededor del 50% de las NLR de S. americanum se encuentran dentro del superclado NRC38 (Fig. 2a). Para investigar la familia NRC, generamos un árbol filogenético para los genes NRC. Encontramos homólogos de NRC1, NRC2, NRC3, NRC4a y NRC6, y dos homólogos de NRC5a en el genoma de S. americanum (Fig. 2b, e). Curiosamente, los genes NRC4b (siete homólogos) se han expandido en el genoma de S. americanum en comparación con Nicotiana benthamiana (dos homólogos) (Fig. 2e). Anteriormente, informamos que Rpi-amr3 y Rpi-amr1 requieren NbNRC2/NbNRC3/NbNRC4 y NbNRC2/NbNRC3 en N. benthamiana, respectivamente29,30. Sin embargo, NRC1 falta en N. benthamiana39. Para probar si NRC1 de S. americanum puede soportar la función Rpi-amr1/Rpi-amr3, clonamos el SaNRC1 de SP1102 y demostramos que SaNRC1 habilita la función Rpi-amr3 pero no Rpi-amr1 en plantas knockout nrc2/mc3/mc4 de N. benthamiana. (Figura complementaria 10). Este resultado indica que distintos miembros en diferentes especies de plantas podrían permitir funciones de NRC.

El genoma de S. americanum y pan-NLRome también nos permitieron investigar la diversidad de genes NLR. Descubrimos que la diversidad de secuencias en las regiones NLR era significativamente mayor que en las regiones que no son NLR (Figura complementaria 11a), de acuerdo con un informe anterior37. Además, encontramos una amplia diversidad de secuencias y variación en el número de copias dentro de los grupos de NLR. Por ejemplo, el locus Rpi-amr3 varió mucho entre los genomas de S. americanum (Figura complementaria 11b), lo que muestra que se requieren genomas de alta calidad para una anotación NLRome confiable.

En resumen, generamos un pan-NLRome de 20 accesiones de S. americanum y anotamos manualmente los genes NLR de tres genomas de referencia. Este recurso es importante para la investigación de la evolución del gen NLR y facilita los estudios funcionales de ETI en S. americanum y otras especies de Solanaceae.

Hay 563 efectores RXLR predichos en el genoma de referencia T30-4 de P. infestans. En este estudio, demostramos que hay ~ 550 genes NLR en los genomas de referencia de S. americanum (Fig. 2d). Para revelar interacciones efector-receptor uno a uno y clonar más receptores inmunes, seleccionamos ~ 315 efectores RXLR en 52 muestras de S. americanum (Fig. 3). Según los datos del ADNc de PenSeq, todos estos efectores RXLR se expresan durante la colonización de una hoja de papa susceptible31. Encontramos que cinco efectores desencadenaron una respuesta hipersensible (HR) en la mayoría de las accesiones de S. americanum (≥ 50), incluidos los efectores de la familia AVRblb2, mientras que 185 efectores no desencadenaron HR en ninguna accesión de S. americanum, 71 efectores fueron reconocidos por menos de cinco accesiones de S. americanum y 54 efectores mostraron reconocimiento diferencial por diferentes accesiones de S. americanum. AVRamr1 (36/52) y AVRamr3 (43/52) también fueron ampliamente reconocidos por diferentes accesiones de S. americanum (Fig. 3). Las cuatro entradas de referencia SP2271, SP2275, SP1102 y SP2273 pudieron reconocer 25, 18, 30 y 30 efectores RXLR, respectivamente, de los cuales 5, 3, 7 y 9 efectores se reconocieron específicamente en cada entrada (Figura complementaria 12). En particular, la accesión SP2271 fue susceptible a P. infestans en el ensayo de hojas desprendidas (DLA), pero la susceptibilidad dependió de la edad (Figura complementaria 1b), y esta accesión es resistente al tizón tardío en el campo. Como era de esperar, SP2271 no reconoció AVRamr1 y AVRamr3. Encontramos codones de parada prematuros en los homólogos de Rpi-amr1 y Rpi-amr3 de SP2271. Curiosamente, 25 efectores RXLR activaron la FC en SP2271. Estos reconocimientos de efectores RXLR podrían contribuir a la resistencia dependiente de la edad y a la resistencia de campo de SP2271 al tizón tardío. En conjunto, estos resultados revelan el panorama ETI de S. americanum contra el patógeno del tizón tardío.

Un total de 315 efectores RXLR se expresaron transitoriamente en 52 muestras de S. americanum. Para el mapa de calor se utilizó el índice de FC (2, FC fuerte; 1, FC débil; 0, sin FC, NA, no disponible). Estos efectores se examinaron en N. benthamiana30 y sus reconocimientos se incluyen en este mapa de calor. Se utilizó el vector PVX vacío como control negativo y la coexpresión de Rpi-amr3 – HisFlag y AVRamr3 – GFP como control positivo. Las accesiones de S. americanum se ordenaron con base en el árbol filogenético; SP3400 no está incluido en este árbol. La barra de escala representa el número de sustituciones de aminoácidos por sitio. Las accesiones de S. americanum se clasificaron en cuatro grupos (sombreado gris o amarillo). Las cuatro accesiones de referencia están marcadas con flechas rojas. Los efectores se ordenaron según el índice de FC total. Para cada efector, el número de accesiones de S. americanum que responden se visualiza mediante un gráfico de barras en la parte superior del mapa de calor. Para cada entrada de S. americanum, el número de efectores reconocidos se visualiza mediante un gráfico de barras a la derecha del mapa de calor. Algunos efectores RXLR previamente caracterizados o mencionados en este estudio se indican con flechas grises.

Para investigar la diversidad genética en las accesiones de S. americanum de nuestra colección, realizamos una secuenciación de extremos pares de 150 pb sin PCR para 52 accesiones de S. americanum con una cobertura de 10 ×. Construimos un árbol filogenético utilizando todos los SNP genéticos, y se utilizaron berenjenas, patatas y tomates como grupos externos (Fig. 3 y Fig. complementaria 13a). También se analizaron los valores de los coeficientes estructurales y de consanguinidad (Figura complementaria 13b, c). Las 52 muestras se pueden asignar en cuatro grupos (Figura complementaria 13a). Las seis muestras del grupo 1 carecían de Rpi-amr1 y Rpi-amr3 según el cribado efectorómico (Fig. 3 y Tabla complementaria 3). SP2275 y SP1102 estaban en el grupo 2 y SP2273 estaba en el grupo 3. No había ningún genoma de referencia disponible para el grupo 4, pero generamos ensamblajes SMRT-RenSeq para varias de estas muestras. Sorprendentemente, cuatro muestras (SP2303, SP2310, SP3393 y SP3051) no estaban estrechamente relacionadas con otros grupos y son altamente heterocigotas (Figura complementaria 13c), lo que sugiere que pueden ser especies poliploides como Solanum nigrum. Otras dos entradas, SP3052 y SP3376, tampoco estaban estrechamente relacionadas con los cuatro grupos de S. americanum y podrían pertenecer a otra especie de Solanaceae. Estos datos de resecuenciación podrían usarse para estudios de asociación de todo el genoma (GWAS) y desarrollo de marcadores moleculares.

Durante la selección de efectosorómicos, encontramos un efector, PITG_22825, que desencadenó la FC en 28 de 52 muestras de S. americanum (Fig. 3 y Tabla complementaria 3), incluidas SP1102 y SP2271, pero no SP2298 (Fig. 4a). PITG_22825 es un efector RXLR con un péptido señal y motivos RQLR y EER seguidos del dominio efector (Fig. 4a). Este efector no había recibido atención antes de nuestro estudio cDNA PenSeq31. Para mapear el gen que confiere su reconocimiento, se realizó un análisis GWAS y se identificó una señal fuerte en un singleton NLR ubicado en el cromosoma 01 de SP1102 (Figs. 2b y 4b). Este gen codifica un CNL que pertenece al clado filogenético CNL-13 Rpi-amr3 (Fig. 2a), aunque el grupo de genes Rpi-amr3 se ubica en el cromosoma 11 (Fig. 2b). Esto indica que el gen candidato en el cromosoma 1 podría haberse translocado desde el locus Rpi-amr3 en el cromosoma 11, lo que probablemente explica otra señal GWAS más débil en el grupo Rpi-amr3 del cromosoma 11 (Fig. 4b). Según los datos de ADNc RenSeq de SP1102, el gen NLR correspondiente lleva un exón adicional en comparación con Rpi-amr3 (Fig. 4b). Para verificar esta señal GWAS, realizamos un análisis segregante masivo y una secuenciación de enriquecimiento de genes de resistencia (BSA-RenSeq) en una población F2 segregante de SP2271 x SP2298 (Figura complementaria 14). El gen sensible PITG_22825 de SP2271 se mapeó en la misma posición en el cromosoma 1 en los genomas de referencia SP2271 y SP1102.

a, PITG_22825 es un efector RXLR. 35S::PITG_22825 desencadena la muerte celular en las hojas de S. americanum SP2271 y SP1102, pero no en las hojas de SP2298. b, gráfico de Manhattan del GWAS del reconocimiento PITG_22825. Los SNP asociados con el reconocimiento PITG_22825 se encuentran en un singleton NLR sp1102chr01_nlr39; (flecha roja). c, ensayo de HR de genes candidatos. Rpi-amr4-1102 y Rpi-amr4-2271 se expresaron solos o coexpresados ​​con construcciones 35S::PITG_22825 o 35S::AVRamr3–GFP en hojas de N. benthamiana. Rpi-amr4-2271 es autoactivo en N. benthamiana, pero cuando se coexpresa con PITG_22825, la FC fue más fuerte. Rpi-amr4-1102 reconoce específicamente PITG_22825. Se utilizó Rpi-amr3 como control. DO600 = 0,5. Se utilizaron cuatro hojas de dos plantas para cada experimento y se realizaron tres réplicas biológicas con los mismos resultados. HF, HisFlag. d, Filogenia de homólogos de Rpi-amr4 en diferentes accesiones de S. americanum. Rpi-amr3 se utilizó como grupo externo. La FC mediada por PITG_22825 se muestra mediante círculos rojos (HR) o azules (sin HR). Se muestra el porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos con respecto a Rpi-amr4-1102. a,c,d–f. Las barras de escala representan el número de sustituciones de aminoácidos por sitio. e, las líneas Rpi-amr4-knockout pierden la capacidad de reconocimiento PITG_22825. Se diseñaron dos sgRNA (flechas negras) en Rpi-amr4-2271. Se muestra el genotipo de las dos líneas knockout. Ninguna de las líneas pudo reconocer PITG_22825, pero HR pudo complementarse al coexpresar PITG_22825 con Rpi-amr4-1102. Se utilizaron plantas SP2271 de tipo salvaje (WT) como plantas de control. Se utilizaron Rpi-amr3 y AVRamr3 como control positivo. DO600 = 0,5. f, DLA con 35S::Rpi-amr4-1102. 35S::Rpi-amr4-1102 (verde), Rpi-amr3 (control positivo, rojo) y Rpi-amr3a (un parálogo de Rpi-amr3 no funcional, control negativo, azul) se expresaron transitoriamente en N. benthamiana, OD600 = 0,5. Se utilizaron zoosporas de la cepa T30-4 de P. infestans para inocular las hojas 1 día después de la infiltración (dpi). Los tamaños de las lesiones se midieron a 6 ppp. Se realizaron cuatro réplicas biológicas y todos los puntos de datos (74 puntos de datos por tratamiento) se visualizaron como un diagrama de caja y bigotes. Línea central, mediana; límites de caja, cuartiles superior e inferior. Los bigotes (superior e inferior) comprenden valores dentro de 1,5 veces el rango intercuartil (IQR). Los valores atípicos se indican con puntos negros. Las diferencias estadísticas se analizaron mediante ANOVA unidireccional con la prueba HSD de Tukey (P <0,001) y se indicaron con letras minúsculas. Se muestran hojas representativas.

Datos fuente

Para probar la función genética, los ORF de los genes candidatos de SP2271 y SP1102 se amplificaron por PCR y se clonaron en un vector binario de sobreexpresión con el promotor 35S y el terminador Ocs y las construcciones resultantes luego se transformaron en Agrobacterium tumefaciens. Los genes candidatos se expresaron en N. benthamiana solos o coexpresados ​​con PITG_22825 o AVRamr3-GFP como control negativo. Se utilizó Rpi-amr3-HisFlag como control positivo. Descubrimos que el alelo SP2271 (Rpi-amr4-2271 en adelante) era autoactivo en N. benthamiana, pero cuando se coexpresaba con PITG_22825, la FC era más rápida y más fuerte en comparación con el control (Fig. 4c). Por el contrario, el alelo SP1102 (en adelante Rpi-amr4-1102) no fue autoactivo en N. benthamiana. La FC se activó cuando Rpi-amr4-1102 se coexpresó con PITG_22825, pero no con AVRamr3-GFP (Fig. 4c). Solo existen tres diferencias de aminoácidos entre las proteínas codificadas por Rpi-amr4-1102 y Rpi-amr4-2271, y estas diferencias podrían causar la autoactividad del alelo SP2271 (Figura complementaria 15). También encontramos que Rpi-amr4 se conservó en las accesiones sensibles a PITG_22825 (Fig. 4d). Para verificar la función de Rpi-amr4, generamos líneas Rpi-amr4-knockout SP2271 mediante CRISPR-Cas9. En total, se generaron 16 líneas knockout de CRISPR-Cas9 (Tabla complementaria 4) y en la Fig. 4e se muestran 2 líneas. El SP2271 de tipo salvaje pudo reconocer PITG_22825, pero las líneas de eliminación Rpi-amr4 no pudieron. El fenotipo HR podría complementarse cuando Rpi-amr4-1102 se coexpresó con PITG_22825 en las líneas knockout (Fig. 4e). Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que Rpi-amr4 codifica el receptor inmunológico que reconoce PITG_22825 y que PITG_22825 es Avramr4.

Para probar si Rpi-amr4 confiere resistencia al tizón tardío, expresamos transitoriamente Rpi-amr4-1102 en hojas de N. benthamiana e inoculamos las hojas con zoosporas de P. infestans. Se usó Rpi-amr3 como control positivo y Rpi-amr3a no funcional de SP1102 como control negativo (Fig. 4f). Este ensayo demostró que Rpi-amr4-1102 confiere resistencia contra el aislado T30-4 de P. infestans. Sin embargo, la resistencia fue más débil que la de Rpi-amr3 (Fig. 4f). También generamos líneas estables de N. benthamiana transgénica Rpi-amr4-1102. Como se esperaba, las plantas transgénicas T0 ganaron la capacidad de reconocimiento de PITG_22825 y fueron resistentes a dos aislados de P. infestans T30-4 y 88069. También verificamos este hallazgo en las líneas transgénicas T1 Rpi-amr4 (Figuras complementarias 16a, b). .

En resumen, clonamos con éxito un nuevo gen Rpi, Rpi-amr4, de S. americanum y definimos su gen efector afín, Avramr4 (PITG_22825). Rpi-amr4 confiere resistencia al tizón tardío y puede servir como recurso para producir patatas resistentes al tizón tardío.

Aunque Rpi-amr4 pudo identificarse utilizando un enfoque GWAS, la cantidad de efectores reconocidos por algunas muestras de S. americanum fue pequeña y no permitió una señal GWAS clara. Por lo tanto, implementamos BSA-RenSeq para clonar dos receptores inmunes más.

PITG_02860 (Fig. 5a) se dirige a la proteína huésped NRL1 y atenúa la inmunidad de las plantas y aumenta la virulencia del patógeno, pero se desconocía el receptor afín40. Descubrimos que PITG_02860 desencadenó HR en 5 de 52 muestras de S. americanum, incluida SP2271. Probamos una población F2 de SP2271 (PITG_02860 sensible, R) × SP2272 (PITG_02860 no responde, NR), y encontramos que el reconocimiento de PITG_02860 se segregaba según una proporción de 3:1 (104 R y 34 NR; χ2 (1, Ν = 138) = 0,00966, P = 0,92169) (Figura 5b). La tubería RenSeq se realizó en la población F2, y la mayoría de los SNP filtrados se ubicaron dentro de una región de 1 Mb en la parte superior del cromosoma 4 de SP2271 (Fig. 5c). Los marcadores SCAR se diseñaron basándose en los datos de la resecuenciación y se utilizaron para el genotipado. El gen candidato se mapeó en una región de 295 kb entre los marcadores S42 y S36. Siete genes NLR residen dentro del intervalo de mapeo y todos pertenecen a la familia R3 (Figs. 2a, by 5c). Para probar estos genes candidatos, los ORF de cuatro genes candidatos (nlr13, nlr14, nlr16, nlr17) se clonaron en un vector binario bajo el control del promotor 35S y el terminador Ocs y se transformaron en Agrobacterium para expresión transitoria. Los genes candidatos se expresaron solos o con PITG_02860 o AVRamr3 en N. benthamiana y Nicotiana tabacum. NLR16 y NLR17 fueron autoactivos en N. benthamiana, pero encontramos que la coexpresión de NLR16 y PITG_02860 activó HR en N. tabacum (Fig. 5d). Para verificar este hallazgo, generamos líneas SP2271 knockout nlr16 utilizando el sistema CRISPR-Cas9. Como era de esperar, las líneas eliminatorias perdieron el reconocimiento de PITG_02860 (Figura complementaria 17). Por lo tanto, concluimos que NLR16 (en adelante R02860) es el receptor inmunológico de PITG_02860.

a, PITG_02860 es un efector RXLR de P. infestans. Se muestran una ilustración y una estructura prevista. b, Se generó una población F2 a partir de un cruce entre SP2271 (responde a PITG_02860, R) y SP2272 (sin respuesta a PITG_02860, NR). La masa R (104 progenies) y la masa NR (34 progenies) se utilizaron para BSA-RenSeq. c, Se identificaron un total de 218 SNP vinculados (puntos rojos) en la parte superior del cromosoma 4 de SP2271. La barra gris representa el cromosoma. Las posiciones físicas (en Mb) se muestran mediante números. Se utilizaron cinco marcadores moleculares (S30, S42, S35, S36 y S31) para la clonación basada en mapas. Se muestra el número de eventos de recombinación por gametos totales probados. d, ensayo de FC del receptor candidato PITG_02860. Los genes candidatos se expresaron solos o coexpresados ​​con PVX::PITG_02860 en hojas de N. tabacum. Se utilizaron Rpi-amr3 y AVRamr3 como controles. NLR16 resultó ser el receptor PITG_02860 (en adelante R02860). DO600 = 0,5. Se utilizaron plantas de N. tabacum de cuatro semanas de edad y las fotografías se tomaron a 4 ppp. Se realizaron tres réplicas biológicas con los mismos resultados. e, PITG_04373 es un efector RXLR de P. infestans. Se muestran una ilustración y una estructura prevista. f, Tanto las poblaciones de retrocruzamiento (BC1) como las de F2 se generaron a partir de SP2271 y SP2300. La población BC1 de 192 plantas receptivas y 182 progenies que no respondieron se agruparon para BSA-RenSeq. Las poblaciones F2 se utilizaron para un mapeo preciso. g, se identificaron SNP informativos (puntos rojos) en la parte superior del cromosoma 10 de SP2271. Se utilizaron cinco marcadores moleculares (S11, S13, S5, S7 y S16) para el mapeo fino. Se muestra el número de gametos de recombinación por cada gameto total analizado. Nueve genes de ensamblajes SP2300 SMRT-RenSeq que se asignaron al intervalo de mapeo del genoma SP2271 se consideraron genes candidatos. Todos los candidatos pertenecen a la familia Rpi-chc1 excepto C444. h, ensayo de FC de los candidatos al receptor PITG_04373. Los genes candidatos se expresaron solos o coexpresados ​​con 35S::PITG_04373 en hojas de N. benthamiana, se utilizaron Rpi-amr3 y AVRamr3 como controles. C168 resultó ser el receptor PITG_04373 (en adelante R04373). DO600 = 0,5. Se utilizaron plantas de N. benthamiana de cuatro semanas de edad y se tomaron fotografías a 4 ppp. Se realizaron tres réplicas biológicas con los mismos resultados.

PITG_04373 (Fig. 5e) desencadenó HR en solo 3 de 50 muestras de S. americanum, incluida SP2300, que porta Rpi-amr1 y Rpi-amr3 funcionales (Fig. 3). Para clonar el gen del receptor inmunológico correspondiente, primero fenotipamos una población de retrocruzamiento BC1 de SP2271 (NR) × SP2300 (R). La población BC1 se segregó para la capacidad de respuesta PITG_04373 con una proporción de 1: 1 (198 R y 182 NR; χ2 (1, N = 380) = 0,67368, P = 0,41177) (Fig. 5f). El ADN de las progenies que respondían o no respondían se agrupó para BSA-RenSeq y la mayoría de los SNP vinculados se asignaron al cromosoma 10 SP2271 (Fig. 5g). Se diseñaron marcadores SCAR y se fenotipó y genotipó una población F2 de SP2271 × SP2300. La capacidad de respuesta de PITG_04373 se asignó a un intervalo de 1,447 Mb con ocho genes basados ​​en el genoma SP2271 (Fig. 5g). La mayoría de los candidatos pertenecen a la familia Rpi-chc1, excepto un homólogo de R1 (Fig. 5g). En ausencia de un genoma de referencia para SP2300, utilizamos el ensamblaje SMRT-RenSeq como referencia NLRome29. Los cóntigs SMRT-RenSeq se asignaron a esta región del genoma SP2271, y los genes candidatos de SP2300 se clonaron en un vector con el promotor 35S y el terminador Ocs para ensayos transitorios. Se probaron cinco genes candidatos (C18.1, C18.2, C127, C168 y C829). Descubrimos que el receptor inmunitario candidato C168 (R04373 en adelante) puede reconocer específicamente PITG_04373 después de una expresión transitoria en N. benthamiana (Fig. 5h). Por lo tanto, concluimos que R04373 es el receptor inmunológico de PITG_04373.

SP2300 también lleva homólogos funcionales de Rpi-amr1 y Rpi-amr3. Para probar la función de R04373 en SP2300, generamos líneas de eliminación triple Rpi-amr1-2300/Rpi-amr3-2300/R04373 (Figura complementaria 18a). Se generaron y fenotiparon cuarenta líneas knockout SP2300 transgénicas y 13 de estas 40 líneas knockout perdieron el reconocimiento de los tres efectores (PpAVRamr1, AVRamr3 y PITG_04373). Se genotiparon dos de estas líneas, SLJ25603#3 y SLJ25603#17, y se confirmaron los eventos de eliminación (Fig. 18b-e complementaria). También coexpresamos R04373 con PITG_04373; sin embargo, el fenotipo HR no se restauró en estas líneas eliminadas (Fig. 18e complementaria) y planteamos la hipótesis de que el fragmento R04373 truncado podría producir ARN de interferencia. Curiosamente, las líneas triple knockout mostraron una susceptibilidad ligeramente elevada a P. infestans (Figura complementaria 18f, g) en comparación con el SP2300 de tipo salvaje, pero fueron más resistentes que el SP2271, lo que sugiere que hay genes Rpi adicionales en SP2300.

Para probar la resistencia al tizón tardío conferida por R02860 y R04373, expresamos transitoriamente R02860, R04373, Rpi-amr4 y sus combinaciones en N. benthamiana y medimos el crecimiento de P. infestans. Sin embargo, aunque observamos una ligera disminución significativa en el tamaño de la lesión después de la expresión transitoria de R02860 y R04373, el patógeno aún podría infectar las plantas. También coexpresamos Rpi-amr4 con R02860 o R04373 sin mejorar la resistencia de Rpi-amr4 (Figura complementaria 19). Estos resultados indican que aunque R02860 y R04373 pueden reconocer los efectores RXLR PITG_02860 y PITG_04373 de P. infestans, P. infestans puede superar la resistencia que confieren.

En resumen, mediante el uso de BSA-RenSeq, SMRT-RenSeq y estrategias de clonación basadas en mapas, clonamos con éxito dos nuevos receptores inmunes, R02860 y R04373, y definimos sus efectores RXLR reconocidos, PITG_02860 y PITG_04373.

Solanum es el género más grande de la familia Solanaceae y comprende más de 1.500 especies, incluidas muchas plantas de cultivo importantes como la papa, el tomate y la berenjena, para las cuales se dispone de amplios datos sobre la secuencia del genoma. El complejo S. nigrum está compuesto por muchas especies con diferentes niveles de ploidía, incluidas S. nigrum (6 ×), Solanum scabrum (6 ×), Solanum villosum (4 ×) y S. americanum (2 ×). Algunas se consideran malas hierbas, pero otras se consumen como alimento y medicina en varios países41. Es importante destacar que estas especies tienen una variación genética valiosa para la resistencia a enfermedades, incluidas, entre otras, el tizón tardío de la papa y el marchitamiento bacteriano25,29,31. En este estudio, secuenciamos y ensamblamos cuatro genomas de S. americanum y generamos conjuntos de datos multiómicos. Estos datos nos permitieron construir una pan-NLRome de S. americanum para estudiar la evolución y función de los genes NLR en S. americanum.

El tizón tardío de la papa desencadenó la hambruna irlandesa en la década de 1840 y sigue siendo un desafío global que limita en gran medida la producción de papa. Para comprender la ETI de S. americanum a P. infestans, utilizamos 'efectorómicas' para analizar las interacciones de ETI entre ellos. Generamos una matriz de 315 efectores RXLR × 52 accesiones de S. americanum. Curiosamente, el reconocimiento de AVRamr1 (36/52) y AVRamr3 (43/52) está ampliamente distribuido en las accesiones de S. americanum, lo que indica que Rpi-amr1 y Rpi-amr3 desempeñan funciones importantes en la resistencia al tizón tardío de S. americanum. Este hallazgo es consistente con las conclusiones de un estudio ETI pangenómico sobre la interacción entre Arabidopsis y Pseudomonas syringae42. Algunos efectores inducen la muerte celular en todas las muestras de S. americanum, como los efectores de la familia AVRblb2 (Fig. 3). Esta observación es consistente con hallazgos previos de que AVRblb2 (PexRD39/PexRD40) induce la muerte celular en todas las especies de papa silvestre analizadas, pero no en N. benthamiana43,44; Esta muerte celular no específica podría ser el resultado de las actividades de virulencia de AVRblb2. Algunas muestras resistentes carecen del reconocimiento de AVRamr1 y AVRamr3 y, por lo tanto, son fuentes valiosas de nuevos genes Rpi.

En este estudio se clonaron tres nuevos receptores inmunes Rpi-amr4, R02860 y R04373 (Figs. 4 y 5). Demostramos que Rpi-amr4 eleva la resistencia de P. infestans en N. benthamiana. Se informó que PITG_02860 promueve la susceptibilidad del huésped al apuntar a la proteína del huésped NRL1 (ref.40), y las funciones de virulencia y los objetivos del huésped de AVRamr4 y PITG_04373 aún están por descubrir. P. infestans es un patógeno de rápida evolución y es posible que pueda superar genes Rpi individuales en el campo en unos pocos años. La resistencia basada en el reconocimiento de un único efector puede superarse fácilmente mediante mutaciones o silenciamiento, como se muestra para Avrvnt1 (refs.45,46). El apilamiento de genes R es una mejor manera de implementar genes R clonados en el campo47,48. Por lo tanto, Rpi-amr4 se puede combinar con otros genes Rpi para proporcionar una resistencia más fuerte y duradera al tizón tardío de la papa.

Los otros dos receptores inmunes R02860 y R04373, que reconocen PITG_02860 y PITG_47373, se clonaron a partir de SP2271 y SP2300, respectivamente. La resistencia conferida por estos genes podría ser demasiado débil para aplicarse en el campo (Figura complementaria 19). Muchos efectores son supresores de la inmunidad del huésped, en particular AVRcap1, que puede atenuar la función de los NLR auxiliares NRC2 y NRC3 (ref.49), y esta atenuación puede explicar por qué algunos receptores inmunes de plantas que reconocen efectores, sin embargo, no confieren una fuerte resistencia a las enfermedades. Para comprender la naturaleza compleja de la interacción planta-patógeno, nuestro trabajo proporciona un ensayo para identificar el supresor de R02860 y R04373 en el futuro.

En resumen, nuestro estudio proporciona valiosas herramientas genómicas y genéticas que deberían acelerar el camino hacia la comprensión y el logro de una resistencia duradera contra el tizón tardío de la papa y otras enfermedades de las plantas y muestra que S. americanum es una excelente planta modelo para estudiar las interacciones moleculares entre plantas y microorganismos y inmunidad.

Se seleccionaron para la secuenciación cuatro muestras representativas de S. americanum, SP1102, SP2271, SP2273 y SP2275. Se aplicó la plataforma Pacific Bioscience Sequel II en el modo de secuenciación circular por consenso (CCS) para secuenciar los genomas de SP1102 y SP2271 y generó 30,5 Gb y 28,5 Gb de lecturas de alta fidelidad (HiFi), respectivamente. Las plataformas PromethION y GridION de Oxford Nanopore Technologies se aplicaron para secuenciar los genomas de SP2273 y SP2275 y generaron ~81,1 Gb y ~114,5 Gb de datos, respectivamente. Para estimar la heterocigosidad del genoma y pulir los genomas ensamblados sin procesar, también preparamos bibliotecas para la secuenciación de lecturas cortas de extremos emparejados de Illumina siguiendo el protocolo estándar y generamos un promedio de 99,2 Gb de datos limpios para cada acceso de S. americanum utilizando Illumina Hiseq 2500. plataforma. Se crearon bibliotecas Hi-C de tres accesiones de S. americanum, SP1102, SP2271 y SP2273, a partir de plántulas jóvenes basadas en la enzima de restricción MboI. Se aplicó la plataforma Illumina Hiseq 2500 para generar 86,5, 81,8 y 54,8 Gb de lecturas de extremos emparejados para SP1102, SP2271 y SP2273, respectivamente.

El tamaño del genoma y la heterocigosidad se estimaron utilizando un enfoque basado en k-mer mediante KAT50 y GenomeScope51. El tamaño estimado del genoma se calculó como el número total de k-mers dividido por la cobertura de secuenciación estimada. El número total de k-mers podría calcularse a partir de los datos de secuenciación y la cobertura de secuenciación podría evaluarse en función de la frecuencia de distribución de k-mer. En este estudio, aplicamos KAT para calcular la frecuencia de k-mer con k = 19 y el script Perl estima_genome_size.pl (https://github.com/josephryan/estimate_genome_size.pl) para estimar el tamaño del genoma de S. americanum. Hifiasm52 se aplicó para ensamblar SP1102 y SP2271 de novo utilizando los parámetros predeterminados. Para ensamblar los genomas de SP2273 y SP2275, primero corregimos las lecturas de ONT usando Canu53 con los parámetros 'correct corOutCoverage=500 corMinCoverage=2 minReadLength=2000 genomeSize=1g -nanopore-raw'. SMARTdenovo54 luego ensambló las lecturas corregidas en contigs sin procesar con los siguientes argumentos de línea de comando 'perl smartdenovo.pl -c 1 -t 24 -k 17'. Luego, los ensamblajes en bruto se pulieron iterativamente utilizando lecturas cortas de Illumina. Las lecturas se alinearon con los ensamblajes sin procesar utilizando BWA55 y los archivos bam resultantes se pasaron a Pilon56 para su pulido. Los pseudocromosomas se construyeron utilizando el exprimidor57 y la tubería 3d-DNA58 con parámetros '-m haploid -i 15000 -r 0'. La calidad de los ensamblajes fue evaluada mediante BUSCO (Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs)59 con la base de datos solanales_odb10.

Para SP1102 y SP2271, para ayudar con la predicción del modelo genético, se secuenciaron los transcriptomas de plántulas enteras, raíces, tallos, hojas, flores y frutos de S. americanum utilizando la plataforma Illumina HiSeq 2500 con tres replicaciones para cada tejido y 4 Gb de material limpio. datos para cada muestra. Las lecturas se alinearon con el genoma mediante HISAT60, las transcripciones se ensamblaron utilizando StringTie61, Cufflinks62 y Trinity63 y luego los ensamblajes se importaron a PASA64 para la predicción de genes codificadores de proteínas. También se realizaron estrategias de búsqueda de proteínas ab initio y homólogas utilizando SNAP65, AUGUSTUS66, GlimmerHMM67 y exonerate68. Toda la evidencia prevista se integró utilizando EVM64. Para predecir modelos genéticos en SP2273 y SP2275, utilizamos los conjuntos de datos ITAG4.0 (ref.14) y SolTub_3.0 (ref.13) para la predicción de genes basada en homología en el programa GeMoMa69. Los datos de RNA-seq obtenidos de SP2273 también se incorporaron para la predicción del sitio de empalme.

Las secuencias de proteínas representativas de Arabidopsis thaliana, Petunia inflata, Capsicum annuum, Solanum melongena, Solanum tuberosum Group Phureja (DM1-3 516 R44), S. tuberosum Group Tuberosum (RH89-039-16), Solanum commersonii, Solanum chacoense, Solanum pennellii. , Solanum pimpinellifolium, Solanum lycopersicum y cuatro muestras de S. americanum (SP1102, SP2271, SP2273 y SP2275) se extrajeron y se ingresaron en OrthoFinder70 para agrupar ortogrupos utilizando el algoritmo MCL. Se extrajeron las secuencias de proteínas de 1.363 ortogrupos de copia única para inferir la relación filogenética siguiendo el método de la supermatriz. Las secuencias de 15 genomas se alinearon usando MAFFT71 con el parámetro '--auto' y se recortaron usando trimAl con los parámetros '-phylip -gt 0.8'. Se aplicó IQ-TREE72 para inferir las relaciones filogenéticas con los parámetros '--alrt 1000 -B 1000'. Utilizamos BASEML y MCMCTREE del paquete de software PAML73 para estimar el tiempo de divergencia. Se extrajeron las secuencias de secuencia de codificación (CDS) de 1363 ortogrupos de copia única para una estimación aproximada de la tasa de sustitución utilizando BASEML con modelo = 7. MCMCTREE con parámetros 'modelo = 7, burnin = 5,000,000, sampfreq = 300, nsample = 20,000' se aplicó para estimar el tiempo de divergencia. Para la calibración se utilizaron los tiempos de divergencia de patata-tomate (7–10 Ma)34 y patata-Arabidopsis (111–131 Ma; http://www.timetree.org/). Se realizaron dos rondas de estimación con resultados similares.

La alineación genómica entre SP1102 y berenjena/patata se realizó utilizando MUMMER74 con los parámetros ' --maxmatch -c 100 -b 500 -l 50 '. La alineación se filtró aún más con los parámetros '-1 -i 80 -l 100'. Luego, el formato delta se convirtió al formato PAF utilizando el script paftools.js75 y se pasó a D-Genies76 para la visualización del diagrama de puntos.

Aplicamos el programa MCscan basado en Python (v1.1.8) (ref. 77) para realizar el análisis sinténico. Se extrajeron las secuencias de proteínas representativas y las anotaciones del modelo genético correspondiente en formato BED de papa (DMv6.1), berenjena (HQ-1315) y cuatro genomas de S. americanum para buscar homólogos con parámetros '-m jcvi.compara.catalog ortholog - -cpuntuación = .99'. Las regiones sinténicas se identificaron con '-m jcvi.compara.synteny screen --minspan=30' y se visualizaron con los parámetros '-m jcvi.graphics.karyotype'.

Para identificar SV grandes (>1 Mb de longitud), alineamos el ensamblaje de grado cromosómico (SP2271 y SP2273) con el genoma de referencia SP1102 utilizando MUMMER con los parámetros: '--lote 1 -t 20 -l 100 -c 500' y filtró aún más la alineación con los parámetros: '-i 90 -l 100'. Se adoptó SyRI v1.4 para identificar SV en función de los archivos delta de alineación; sólo se conservaron los SV grandes para análisis posteriores. Adoptamos el mapa de interacción Hi-C y la ubicación de SV para validar los SV grandes. De los 70 SV identificados en SP2271 y SP2273, 68 SV residen en un solo contig, lo que sugiere una alta confiabilidad. De estos, 40 SV pudieron verificarse mediante un mapa de interacción Hi-C.

El enfoque basado en ensamblaje se aplicó para identificar SV (> 40 pb de longitud) entre los genomas de S. americanum siguiendo el proceso de SVIM-asm78. Los ensamblajes contig de SP2271, SP2273 y SP2275 se alinearon con la referencia SP1102 usando minimap2 (ref.76) con los siguientes parámetros '--paf-no-hit -a -x asm5 --cs -r2k'. Los SV, que consisten en inserciones, eliminaciones, duplicaciones e inversiones, se identificaron utilizando SVIM-asm con modo 'haploide'. Los SV fueron anotados además por SnpEff79.

Utilizamos la información SV generada por SVIM-asm y un método de ventana deslizante (ventana = 500 kb, paso = 50 kb) para calcular la diversidad de secuencias en todo el genoma de S. americanum. La diversidad de una ventana se calculó de la siguiente manera: diversidad = (suma de la longitud de SV en una ventana) / longitud de la ventana. El valor de diversidad final de cada ventana se generó a partir del promedio de SP2271, SP2273 y SP2275. Los valores de diversidad más altos se refieren a niveles de variación más altos de una ventana. Si una ventana se superponía a un gen NLR, esta ventana se contaba como una región NLR y se extraía un total de 2.304 regiones NLR del genoma SP1102. Para comparar las variaciones entre las regiones NLR y las no NLR, seleccionamos al azar 2304 regiones no NLR y comparamos sus valores de diversidad con los de las regiones NLR mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. Se realizaron diez rondas de selección aleatoria y comparaciones entre regiones no NRL y regiones NLR.

Los genes NLR de los cuatro genomas de referencia de S. americanum fueron predichos por NLR-annotator80. Para obtener un mejor modelo genético para estos genes NLR, todos los genes NLR de los genomas SP2271, SP1102 y SP2273 se curaron manualmente. En resumen, los resultados del anotador NLR se importaron a Geneious (v10.2.6) (ref. 81) a medida que se extrajeron las anotaciones de los genomas de referencia y los fragmentos NLR predichos con secuencias flanqueantes de 2 kb de ambos lados. Luego se utilizó Augustus66 para predecir el modelo genético basado en el conjunto de datos entrenado del tomate. Los modelos genéticos se seleccionaron en función de genes NLR funcionalmente validados de bases de datos públicas y también se utilizaron datos de ADNc RenSeq para ayudar en la anotación manual.

Para inferir la filogenia de los NLR, las secuencias de proteínas para el dominio NB-ARC encontradas usando el anotador NLR se alinearon usando MAFFT71 y se usó IQ-TREE para construir un árbol filogenético. ModelFinder82 seleccionó el modelo de sustitución JTT + F + R9 y lo utilizó para inferir el árbol de máxima verosimilitud. El arranque ultrarrápido (UFBoot)83 se configuró en 1000. Se seleccionó CED-4 de C. elegans como grupo externo.

Para analizar la presencia y ausencia de NLR en los genomas de S. americanum, recopilamos 13 ensamblajes SMRT RenSeq informados anteriormente y generamos 3 nuevos ensamblajes a partir de las muestras SP2298, SP3370 y SP2308. Se utilizó el anotador NLR para anotar los genes NLR en el conjunto de datos SMRT-RenSeq. Utilizamos GMAP84 para predecir los homólogos de NLR entre los genomas de S. americanum y los ensamblajes SMRT-RenSeq. Las secuencias CDS de NLR seleccionadas manualmente en el genoma SP1102 se extrajeron y se mapearon en los tres genomas de S. americanum y 16 ensamblajes SMRT RenSeq usando GMAP con parámetros '-f 2 -n 1 --min-cobertura recortada = 0,70 --min -identidad=0,70'. Los NLR que no lograron alinearse se marcaron como ausentes. En la biblioteca RenSeq v485, se incluyeron más cebos en comparación con la biblioteca RenSeq v3; por lo tanto, si un determinado NLR estaba ausente en todos los ensamblajes de RenSeq v3 pero estaba presente en los ensamblajes v4, la ausencia podría ser un falso positivo y se marcaría como NA. Para calcular el nivel de expresión de los genes NLR en SP1102, se aisló ARN de hojas jóvenes de SP1102 y se realizó ADNc RenSeq como se describió anteriormente86. Mapeamos las lecturas del ADNc RenSeq de SP1102 a su genoma usando STAR (2.6.0c) (ref. 87), los archivos BAM se importaron a Geneious (v10.2.6) (ref. 81) y se calcularon los valores de TPM para los genes NLR. utilizando la función 'Calcular niveles de expresión'. Los resultados de filogenia NLR, TPM y PAV se pasaron al software en línea iTOL88 para su visualización final.

OrthoFinder clasificó las secuencias de proteínas NLR de 4 conjuntos de genomas, así como 16 conjuntos SMRT-RenSeq, en ortogrupos utilizando el algoritmo MCL. Luego, la matriz de ortogrupos se procesó con PanGP (v.1.0.1) (ref. 89) utilizando el algoritmo aleatorio. El tamaño de la muestra y los parámetros de repetición de la muestra se establecieron en 500 y 30, respectivamente. Estos parámetros indican que para cada número de accesión dado (n), se seleccionarán aleatoriamente n accesiones para el análisis NLR pan- y central. Se realizó una selección aleatoria de 500 veces con 30 réplicas. El tamaño estimado de las NLRomes pan- y core se ilustró con un diagrama de caja y se ajustó con modelos exponenciales. Los ortogrupos se clasificaron en tres categorías según su frecuencia de aparición: núcleo (ortogrupos presentes en las 18 a 20 muestras); prescindibles (ortogrupos que faltaron en más de 3 muestras y estuvieron presentes en al menos 2 muestras); y únicos (ortogrupos presentes en solo 1 accesión). Para cada adhesión, el número de NLR en diferentes categorías se resumió y se ilustró con un gráfico de barras apiladas.

Se tomaron muestras y se aisló el ADN genómico de hojas jóvenes de 4 semanas de edad de 52 accesiones de S. americanum utilizando un kit de plantas Qiagen DNeasy (Qiagen, 69104). Novogene (Beijing, China) generó y secuenció una biblioteca Illumina de extremo emparejado de 2 × 150 pb sin PCR de genoma completo, generando ~ 10 Gb de datos para cada acceso de S. americanum. Las lecturas sin procesar se recortaron utilizando trimmomatic v0.36 (ref. 90). Las lecturas limpias de cada accesión se asignaron al genoma de referencia SP1102 con minimap2 (v2.16) (ref. 75) y se convirtieron al formato BAM con samtools (v1.9). La llamada SNP se realizó con samtools y bcftools (v1.9).

Para inferir las relaciones filogenéticas de las accesiones de S. americanum, seleccionamos los genomas de papa (DM 1-3 516 R44 v6.1), tomate (Heinz 1706 v4.0) y berenjena (v3) como grupo externo. Se utilizó Wgsim (https://github.com/lh3/wgsim) para simular lecturas de secuenciación del genoma completo de los genomas de papa, tomate y berenjena con parámetros: '-e 0 -d 350 -N 500000000 -1 150 -2 150 -r 0 -R 0 -X 0'. El mapeo de lecturas simuladas y la llamada a SNP se realizaron utilizando los mismos enfoques. Se utilizó Bedtools (v2.17) para extraer SNP en regiones codificantes. IQ-TREE infirió el árbol filogenético basado en SNP con UFBoot configurado en 1000 y el modelo de mejor ajuste TVMe+R2, que fue seleccionado automáticamente por ModelFinder. El árbol filogenético se visualizó con FigTree (v1.4.4).

Para el análisis GWAS, todos los SNP que residen en las regiones del gen NLR, así como las regiones de 3 kb en sentido ascendente y de 1 kb en sentido descendente, se extrajeron con bedtools (v2.17). Los SNP se filtraron y procesaron usando Plink (v1.90) con los parámetros '--make-bed --allow-extra-chr --allow-no-sex --mind 1 --maf 0.05 -geno 0.05 --recode - -afuera'. Las puntuaciones de capacidad de respuesta de cada efector se utilizaron como fenotipo y se pasaron a Plink para el análisis de asociación con los parámetros '--allow-extra-chr --allow-no-sex --assoc --bfile --pheno'. El gráfico de Manhattan se creó utilizando el paquete R qqman (v0.1.8).

Se utilizó una biblioteca de efectores RXLR de 311 efectores RXLR en la selección de efectosorómicos. Se eliminaron los péptidos señal y los dominios efectores se clonaron en vectores de sobreexpresión (pMDC32 o pICSL86977) o vectores PVX. Se cultivaron plantas de S. americanum en un invernadero de contención. Para la agroinfiltración se utilizaron plantas de cuatro o cinco semanas de edad. Para los vectores de sobreexpresión, la muerte celular se calificó a 4 ppp; para los vectores PVX, la muerte celular se calificó a 7 ppp. DO600 = 0,5. Se calificó el fenotipo de muerte celular (2, HR fuerte; 1, HR débil; 0, sin HR). Para cada experimento se utilizaron dos hojas de dos plantas cada una.

Para verificar los genes candidatos, el ORF de cada gen candidato se amplificó mediante ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion (NEB, M0530S) o ADN polimerasa KAPA HiFi Uracil+ (Roche, 07959052001) y luego se clonó en el vector de sobreexpresión pICLS86922 con el promotor 35S y Terminador Ocs usando BsaI (NEB, #R3733) o un vector de clonación USER (pICSLUS0004OD) con el promotor 35S y terminador Ocs usando la enzima USER (NEB, #M5508). Las construcciones verificadas se transformaron en Agrobacterium para su expresión transitoria en plantas.

Para las construcciones knockout, se diseñaron ARN guía en Geneious (v10.2.6) utilizando la función 'Buscar sitio CRISPR' con parámetros: 'Máximos desajustes permitidos contra objetivos fuera de objetivos = 3; Las discrepancias máximas permitidas son indeles = 0; emparejar sitios CRISPR: superposición máxima de sitios emparejados = 100; Espacio máximo permitido entre sitios emparejados = 300'. Se utilizó el genoma de referencia o el ensamblaje SMRT-RenSeq para calificar la actividad fuera del objetivo. Los ARN guía seleccionados se muestran en la Tabla complementaria 3. Se amplificaron dos ARN guía para cada gen candidato con el andamio de ARNsg mediante ADN polimerasa de alta fidelidad Q5 (NEB, M0491S) y se utilizó el vector pICSL70001 como plantilla. Luego, los fragmentos se fusionaron con un promotor U6-26 de Arabidopsis (pICL90002) y se clonaron en vectores de nivel 1 en diferentes posiciones (posición 3, pICH47751; posición 4, pICH47761; posición 5, pICH47772; posición 6, pICH47772). Para las construcciones finales de nivel 2, Cas9 con intrones (posición 1, pICSL11197), NPTII (posición 2, pICSL11055), un conector final (pICH41922) y los ARN guía se ensamblaron en pICSL4723_OD. Luego, las construcciones finales se transformaron en accesiones de S. americanum a partir de la eliminación genética. Después de la transformación, las líneas T0 se trasladaron a un invernadero de contención para el fenotipado y el genotipado. Para el fenotipado se utilizó agroinfiltración del efector correspondiente. Se aisló el ADN genómico de las líneas T0 individuales y se diseñaron cebadores específicos para el gen Cas9 y los genes diana. Los amplicones de los genes diana se subclonaron en el vector de clonación pGEM-Teasy TA (Promega, A1360) o pICSL86977 para la secuenciación. Los datos de secuenciación se analizaron en Geneious (v10.2.6).

N. benthamiana y N. tabacum cv. Las plantas de Petit Gerard se sembraron y cultivaron en una sala de ambiente controlado (CER) a 22 °C y 45-65% de humedad con un fotoperíodo de 16 h. Para el ensayo de HR se utilizaron plantas de cuatro semanas de edad.

Para la transformación de S. americanum, se sembraron semillas esterilizadas (SP2271 y SP2300) en medio MS (2% sacarosa). Se cortaron discos de hojas de plantas in vitro de 4 a 6 semanas de edad. Se añadieron cultivo de Agrobacterium (AGL1) durante la noche (100 µl) y acetosiringona 200 µM a 20 ml de caldo LSR y los discos de hojas se sumergieron suavemente en la solución usando unas pinzas estériles durante 20 minutos. Luego se retiraron los discos de hojas de la suspensión de Agrobacterium, se secaron y se incubaron en condiciones de poca luz a 18-24 °C durante 3 días. Los discos de hojas secas se sembraron en medio sólido LSR1 + acetosiringona 200 µM. Los explantes cocultivados se transfirieron a medio LSR1 en placas de Petri con antibióticos de selección (aproximadamente siete discos de hojas por placa). Los explantes se subcultivaron en medio LSR1 fresco aproximadamente cada 14 días. Una vez que los callos estuvieron suficientemente desarrollados, se transfirieron al medio LSR2. El subcultivo continuó cada 14 días cuando comenzaron a aparecer los brotes. Los brotes se eliminaron con un bisturí afilado y se plantaron en medio sólido MS2R con antibióticos de selección. Las plantas transgénicas que albergan genes apropiados de resistencia a antibióticos o herbicidas deberían enraizar normalmente hacia la cuarta semana y luego pueden retirarse del cultivo de tejidos y colocarse en bloques de turba estériles antes de transferirse al invernadero. Los medios utilizados tenían los siguientes componentes: caldo LSR (medio MS 1x, sacarosa al 3%, pH 5,7); medio LSR1 (medio MS 1x, 3 % de sacarosa, 2,0 mg L-1 de ribósido de zeatina, 0,2 mg L-1 de NAA, 0,02 mg L-1 de GA3, 0,6 % de agarosa, pH 5,7); medio LSR2 (medio MS 1x, 3 % de sacarosa, 2,0 mg L-1 de ribósido de zeatina, 0,02 mg L-1 de GA3, 0,6 % de agarosa, pH 5,7); MS2R (medio MS 1x, sacarosa al 2 %, 100 mg L-1 de mioinositol, 2,0 mg L-1 de glicina, Gelrite al 0,2 %, pH 5,7).

Se utilizaron aislados de P. infestans T30-4 y 88069 para la prueba de la enfermedad y se mantuvieron en medio agar de centeno y sacarosa (RSA) en una incubadora a 18 °C. Para inducir zoosporas, se añadió agua helada a las placas después de 10 a 14 días. Luego, las placas se incubaron a 4 ° C durante 1 a 2 h y se usó un hemocitómetro para contar el número de zoosporas. La suspensión de zoosporas se utilizó para el DLA (100 a 500 zoosporas por gota).

En este estudio se utilizaron tres poblaciones cartográficas: (1) poblaciones F2 de SP2271 × SP2272 y (2) poblaciones BC1 y (3) F2 de SP2271 × SP2300. Las poblaciones fueron fenotipadas mediante agroinfiltración de efectores RXLR. Se utilizó un barrenador del corcho para el muestreo y se combinaron los discos foliares de las progenies sensibles y no sensibles. El ADN genómico se aisló utilizando el kit de plantas Qiagen DNeasy (Qiagen, 69104). Luego se prepararon bibliotecas RenSeq, como se describió anteriormente24. Las bibliotecas fueron secuenciadas (lecturas de Illumina 2 × 250 pb) por Novogene (Beijing, China). Los pasos de filtrado y llamada de SNP se describieron anteriormente26.

Para diseñar marcadores moleculares, las lecturas de resecuenciación sin PCR 10X se asignaron al genoma de referencia SP2271 S. americanum. Luego se diseñaron marcadores SCAR que se vinculaban con las señales BSA-RenSeq; Los amplicones sólo deben estar presentes en el alelo que no responde. Los marcadores SCAR se probaron primero en las líneas parentales y luego los marcadores verificados se usaron en ADN genómico de plantas individuales que no respondieron. Se utilizó ADN polimerasa GoTaq G2 (Promega, 0000066542) para el genotipado.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de secuenciación sin procesar y los conjuntos de genomas de SP1102, SP2271, SP2273 y SP2275 se han depositado en el Archivo de lectura de secuencias (SRA) del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) con el número de acceso de BioProject PRJNA845062; Los datos sin procesar de SMRT RenSeq se depositaron en ENA con el número de proyecto PRJEB38240. Los datos de resecuenciación del genoma completo se depositaron en ENA con el número de proyecto PRJEB57057. Los datos de BSA-RenSeq se depositaron en ENA con los números de proyecto PRJEB57070 y PRJEB57074. Los genomas ensamblados, las anotaciones de la estructura genética, los ensamblajes SMRT-RenSeq y los genes NLR anotados manualmente, así como la información de variación, están disponibles en Figshare (https://figshare.com/projects/The_Solanum_americanum_pangenome_and_effectoromics_reveals_new_resistance_genes_against_potato_late_blight/145449). Las secuencias SaNRC1-1102, SaNRC2-1102, SaNRC3-1102, Rpi-amr4-1102, Rpi-amr4-2271, R02860 (Rpi-amr16) y R04373 (Rpi-amr17) se depositaron en NCBI GenBank con el número de acceso OP918030 – OP918036. . Los datos originales se proporcionan con este documento.

Los scripts y códigos personalizados utilizados en este estudio están disponibles en Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.7928678)91.

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Esta investigación fue financiada por las subvenciones BBSRC BB/P021646/1 (JDGJ), BB/S018832/1 (JDGJ), BB/W017423/1 (JDGJ), la Gatsby Charitable Foundation (JDGJ), el Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China. (2019YFA0906200, SH), Proyecto principal de investigación básica y aplicada de Guangdong (2021B0301030004, SH), Programa de innovación en ciencia y tecnología agrícola (CAAS-ZDRW202101, SH), Fondo de formación de talentos destacados de Shenzhen (SH), Fundación Nacional de Investigación de Corea ( 2018R1A5A1023599 y 2023R1A2C3002366, KHS) y Programa de Desarrollo de Nuevas Tecnologías de Mejoramiento (PJ015799 y PJ016538, SJP). Agradecemos al equipo de transformación de TSL (A. Wawryk-Khamdavong), al equipo de SynBio (M. Youles y L. Egan), a los servicios de medios (N. Stammars), al equipo de bioinformática (D. MacLean y C. Jégousse) y al equipo de horticultura (S. Perkins, J. Smith, L. Phillips, C. Taylor, T. Wells, D. Alger y S. Able) por su apoyo. Agradecemos a P. Robinson (JIC) por la fotografía científica. Agradecemos a S. Marillonnet (Icon Genetics GmbH, Halle/Saale, Alemania) por compartir la construcción Cas9 (pAGM47523). Agradecemos al Jardín Experimental y al Banco de Genes de la Universidad de Radboud, Nijmegen, Países Bajos, IPK Gatersleben, Alemania y S. Knapp (Museo de Historia Natural, Londres, Reino Unido) por el acceso a la diversidad genética de S. americanum. Agradecemos a VGAA Vleeshouwers de la Universidad e Investigación de Wageningen, P. Birch, I. Hein y B. Harrower del Instituto James Hutton por poner a disposición clones de algunos efectores. Agradecemos a BBH Wulff, S. Arora y K. Gaurav (JIC) por sus útiles debates.

Maxim Prokchorchik

Dirección actual: Grupo de Patología Vegetal, Instituto de Ciencia de Cultivos y Conservación de Recursos, Universidad de Bonn, Bonn, Alemania

Estos autores contribuyeron igualmente: Xiao Lin, Yuxin Jia.

El Laboratorio Sainsbury, Universidad de East Anglia, Norwich Research Park, Norwich, Reino Unido

Xiao Lin, Robert Heal, Maria Sindalovskaya, Andrea Olave-Achury, Moffat Makechemu, Sebastian Fairhead, Azka Noureen, Kamil Witek, Matthew Smoker, Jodie Taylor, Ram-Krishna Shrestha y Jonathan DG Jones

Laboratorio Estatal Clave de Genómica Vegetal, Instituto de Microbiología, Academia China de Ciencias, Beijing, China

Xiaolin

Sucursal de Shenzhen, Laboratorio de Agricultura Moderna de Lingnan de Guangdong, Laboratorio de Análisis del Genoma del Ministerio de Agricultura y Zonas Rurales, Instituto de Genómica Agrícola de Shenzhen, Academia China de Ciencias Agrícolas, Shenzhen, China

Yuxin Jia, Chunzhi Zhang y Sanwen Huang

Laboratorio clave para la biología de la papa de la provincia de Yunnan, Academia Conjunta CAAS-YNNU-YINMORE de Ciencias de la Papa, Universidad Normal de Yunnan, Kunming, China

Yuxin Jia

Departamento de Ciencias de la Vida, Universidad de Ciencia y Tecnología de Pohang, Pohang, República de Corea

Maxim Prokchorchik, Yoonyoung Lee y Kee Hoon Sohn

Departamento de Ciencias Biológicas e Instituto de Ciencias Básicas, Universidad Wonkwang, Iksan, República de Corea

Jung Heo y Soon Ju Park

División de Ciencias de la Vida Aplicadas y Centro de Investigación de Biotecnología y Biología Molecular Vegetal (PMBBRC), Universidad Nacional de Gyeongsang, Jinju, República de Corea

Pronto Ju Park

Escuela de Biociencia Interdisciplinaria y Bioingeniería, Universidad de Ciencia y Tecnología de Pohang, Pohang, República de Corea

Kee Hoon Son

Departamento de Biotecnología Agrícola, Universidad Nacional de Seúl, Seúl, República de Corea

Kee Hoon Son

Centro de Investigación de Inmunidad Vegetal, Universidad Nacional de Seúl, Seúl, República de Corea

Kee Hoon Son

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XLYJ, KHS, SH y JDGJ concibieron y diseñaron el proyecto. XL y YJ escribieron el primer borrador con el aporte de todos los autores. XL, YJ, KHS, SH y JDGJ revisaron y editaron el manuscrito. YJ, MP, XL, RKS y JH realizaron los análisis bioinformáticos. XL y MM realizaron la detección efectorómica. XL, RH, MS, ACOA, SF y AN contribuyeron a la clonación y caracterización de Rpi-amr4, R02860 y R04373. M. Smoker y JT realizaron la transformación de la planta. KW, YL, CZ, SJP, KHS, SH y JDGJ contribuyeron con recursos.

Correspondencia a Xiao Lin, Kee Hoon Sohn, Sanwen Huang o Jonathan DG Jones.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Genetics agradece a Doil Choi, Xiu-Fang Xin y Jack H. Vossen por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Notas complementarias 1 a 3 y figs. 1–19.

Tablas_suplementarias

Relación filogenética de S. americanum y especies vecinas; Sintenia del genoma de S. americanum, patata y berenjena.

La medida del tamaño de la lesión.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Lin, X., Jia, Y., Heal, R. et al. Descubrimiento de receptores inmunitarios asistido por el genoma de Solanum americanum que detectan efectores patógenos del tizón tardío de la papa. Nat Genet (2023). https://doi.org/10.1038/s41588-023-01486-9

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Recibido: 12 de agosto de 2022

Aceptado: 21 de julio de 2023

Publicado: 28 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41588-023-01486-9

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